Riassunto / Abstract

Una delle principali differenze tra cellule procariote ed eucariote è che, mentre nelle prime il DNA si trova disperso nel citoplasma, nelle seconde è avvolto da una membrana tale da formare una struttura detta “nucleo”. Durante la normale vita cellulare, la cromatina (associazione DNA-proteine) si presenta come una massa amorfa dispersa all’interno del nucleo. Quando arriva per la cellula, il momento di dividersi, il DNA viene prima duplicato e successivamente addensato e organizzato in strutture chiamate cromosomi, facilmente visibili attraverso un normale microscopio ottico. Il processo di duplicazione/divisione cellulare si chiama mitosi ed assicura il corretto contenuto di materiale genetico a ciascuna cellula figlia. Nel corso dell’esperienza si osserveranno le fasi del processo mitotico in apici radicali di cipolla dove è presente un’intensa attività proliferativa.

Scheda sintetica delle attività

L’osservazione proposta è compiuta su apici radicali di cipolla, per far sviluppare i quali, bisogna immergere, prima dell’esperienza, la cipolla in acqua per qualche giorno solo con la parte radicale.
Una volta prelevati gli apici, li si tratta con blu di toluidina o con il reattivo di Schiff (mediante reazione PAS) che penetra nella cellula vegetale, colora il DNA rendendo perciò visibili i cromosomi.
In seguito alla preparazione e alla colorazione dei vetrini, attraverso l’uso di un microscopio ottico, dovrebbero essere visibili e distinguibili tutte le fasi della mitosi.

Risorse necessarie

Campione da esaminare, cioè cipolla precedentemente immersa in acqua per qualche giorno solo con la parte radicale;
HCl (soluzione di acido cloridrico 5 M);
capsule Petri;
colorante: Blu di Toluidina (soluzione allo 0,05%) o reattivo di Schiff (reazione PAS) o altro colorante nucleare;
vetrini per microscopio ottico, coprivetrini e pinzette;
forbici;
acqua distillata;
pipetta munita di tettarella o flacone con contagocce;
carta assorbente;
microscopio ottico (con eventuale macchina fotografica e raccordi di montaggio).

Prerequisiti necessari

Conoscere la differenza tra cellula procariote ed eucariote;
conoscere la differenza tra cellula animale e vegetale;
conoscere il ciclo cellulare;
saper distinguere le varie fasi mitotiche;
saper usare il microscopio ottico.

Obiettivi di apprendimento

Esprimere i concetti acquisiti con terminologia e simbolismo appropriato;
saper individuare e distinguere gli aspetti rilevanti del fenomeno biologico esaminato;
saper organizzare l’attività di laboratorio seguendo la procedura fornita;
saper organizzare le fasi mitotiche in successione dall’osservazione al microscopio ottico (applicare le conoscenze alla pratica laboratoriale).

Dotazioni di sicurezza

Nessuna precauzione particolare tranne il rispetto delle normali prassi di laboratorio come l’uso di guanti in lattice e occhiali di protezione per eventuali schizzi dei reagenti.
Allo scopo di evitare agli studenti, i rischi associati all’utilizzo di acidi inorganici forti concentrati, la soluzione di HCl 5 M in uso in questa esperienza, deve essere preparata dal personale tecnico di laboratorio o dal docente. Leggere attentamente la scheda di sicurezza dell’HCl e le misure di primo soccorso in caso di contatto con la pelle e/o gli occhi.

Svolgimento

Descrizione del percorso

Scopo di questa esperienza è guidare gli studenti verso un percorso di apprendimento che consolidi le conoscenze teoriche affrontando i fenomeni scientifici mediante l’approccio sperimentale. Generare curiosità, far formulare ipotesi di fronte agli interrogativi che di volta in volta si pongono durante la pratica laboratoriale, lasciare effettuare loro osservazioni scientifiche in maniera inconsapevole, libera e spontanea, presenta enormi potenzialità di sviluppo nell’ambito delle scienze e consolida situazioni e concetti. È importante che prima del lavoro gli studenti vengano divisi in gruppi di 3-5 persone opportunamente scelte dal docente in funzione delle capacità dei singoli componenti e delle affinità di ciascuno con gli altri appartenenti al gruppo. Si rivela utile sottolineare agli studenti come l’attività che si propone non debba essere intesa come competizione ma come collaborazione, questo allo scopo di far partecipare tutti, ciascuno con le proprie capacità per portare armonia e cooperazione all’interno del proprio gruppo. È fondamentale che tutti i componenti del gruppo partecipino alla formulazione delle ipotesi prima e nel corso dell’esperimento. Suggerisco di stimolare domande anche e soprattutto dirette ai componenti del gruppo meno attivi e più timidi, in modo da invitarli alla discussione comune finalizzata alla costruzione dei saperi e all’acquisizione delle competenze. La domanda stimolo iniziale potrebbe essere: “Quale parte della cipolla suggerisci di scegliere per osservare la mitosi?”- “Perchè hai scelto questa parte?”, e successivamente: “Ci sono differenze cellulari/tissutali tra le varie parti del bulbo in esame? Perchè?”.
Proporre queste domande li aiuterà a costruire una rete di significati a partire dalle cose semplici, della vita quotidiana.

Raccolte tutte le ipotesi si procederà quindi con la proposta dell’esperienza di laboratorio.

Esecuzione

Prelevare giovani apici radicali lunghi 4-5 mm circa e posizionarli in una capsula Petri (negli apici radicali più giovani è più intensa l’attività di moltiplicazione cellulare per mitosi).
Lasciare cadere qualche goccia di HCl diluito (5 M) sui campioni, chiudere la capsula con il suo coperchio ed aspettare 15 minuti. (L’acido cloridrico ha la funzione di indebolire le pareti cellulari e quindi di consentire l’ingresso del colorante nella cellula).
Lavare gli apici in acqua distillata; si può utilizzare il coperchio Petri ricoperto da un piccolo strato di acqua. (Il lavaggio con acqua elimina l’acido cloridrico).
Tagliare e prelevare gli apici ed appoggiarli su un vetrino, aggiungere qualche goccia di colorante (blu di toluidina) ed aspettare 5-10 minuti. Questa è la fase più delicata dell’esperienza: occorre sminuzzare con le pinzette quanto più è possibile gli apici in modo da consentire il maggiore assorbimento del colorante (Il blu di toluidina colora il DNA, rende perciò visibili i cromosomi).
Coprire il campione con il vetrino copri-oggetto e cercare di ridurre al minimo lo spessore del campione; sarebbe ottimale ottenere un singolo strato di cellule, perché il preparato deve essere trasparente alla luce).
Introdurre alcune gocce di acqua distillata tra il vetrino e il copri-oggetto per lavare gli apici schiacciati ed eliminare il colorante in eccesso, avendo cura di raccogliere il colorante rimosso con un pezzetto di carta assorbente posizionato dalla parte opposta da cui è stata inserita l’acqua. (L’acqua consente l’allontanamento del colorante che non è stato assorbito dalle cellule).
Se si vuole conservare il vetrino per 2-3 giorni, sigillare i bordi del copri-oggetto con smalto per unghie trasparente. (Lo smalto impedisce la disidratazione del campione).
Osservare al microscopio ottico.
In seguito alla preparazione e alla colorazione dei vetrini dovrebbero essere osservabili tutte le fasi della mitosi.

Suggerimenti utili

Attualmente, la microscopia ottica è una tecnica considerata scontata o banale e per questo raramente ne vengono approfondite le complesse basi teoriche. Quasi tutti i laboratori hanno a disposizione microscopi ottici per diverse applicazioni ma la loro manutenzione e spesso trascurata o assente, con ottiche non pulite ed assi ottici disallineati; l’osservazione immancabilmente risulta compromessa. Consiglio pertanto controlli periodici, a seguito delle operazioni di smontaggio dello strumento in occasioni dei normali interventi di pulizia e manutenzione, mirati all’allineamento parziale o totale da effettuare con cadenza annuale o più ravvicinata in funzione dell’uso che si fa dello strumento.

Protocollo alternativo di colorazione: in luogo della colorazione con Blu di Toluidina, può essere impiegata la reazione PAS prodotta dal reattivo di Schiff (fucsina bianca) che mette in evidenzia i componenti tissutali contraddistinti dalla presenza di gruppi glicolici o aminoidrossilici adiacenti, conferendo una caratteristica colorazione rosso-magenta. L’HIO4, ossida selettivamente e blandamente tali gruppi senza far proseguire l’ossidazione dei gruppi ossidrilici a carbossilici, bensí bloccando l’ossidazione a livello del gruppo aldeidico. A questo punto il reattivo di Schiff, reagendo con due gruppi aldeidici, forma la cosiddetta leucobase di Schiff che mostra un colore magenta intenso al microscopio.

Possibili argomenti di discussione

Tecniche di preparazione di reperti per la visualizzazione al microscopio (fissazione, disidratazione, indurimento, affettatura, colorazione, montaggio).
Differenze tra microscopia ottica ed elettronica (SEM, TEM) e relativo potere di risoluzione.
Differenze tra la citodieresi in cellule animali e vegetali.

Note e storia

Esistono diversi protocolli che permettono di colorare ed evidenziare strutture cellulari differenti. Ciascun metodo e ciascuna colorazione è specifica per un tessuto o una o più componenti cellulari e deve essere scelta sulla base di ciò che si vuole mettere in evidenza. È possibile dunque utilizzare colorazioni specifiche per nucleo piuttosto che citoplasma, tessuto epiteliale piuttosto che collagene e così via.

Bibliografia

Autori

Fontanella Cecilia

Specifiche esperimento

Materia
Biologia
Classi a cui è rivolto
1° biennio
Tipologia di laboratorio
Strumentazione semplice
Reperibilità del materiale
Uso quotidiano, negozi specializzati, siti web
Materiale specifico
Cipolla, capsule Petri, colorante nucleare, vetrini per microscopio, coprivetrini e pinzette, forbici, acqua distillata,
pipetta, carta assorbente, microscopio, DPI
Durata esperimento in classe
2 h
Capacità di bricolage/assemblaggio
No
Necessità lavorazioni meccaniche/elettroniche
No
Necessità PC per acqusizione/analisi dati
No
Necessità di uno smartphone
No
Parole chiave
Biologia
Biologia cellulare
Mitosi
Cromosomi