Estrazione di DNA

L’acido deossiribonucleico (DNA) è la molecola biologica composta da nucleotidi che contiene tutte le informazioni genetiche necessarie per la costruzione, la sopravvivenza e la riproduzione di un vivente, sia che si tratti di un piccolo organismo unicellulare o dell’essere umano. Negli organismi superiori il DNA è contenuto nel nucleo delle cellule, nei mitocondri e nei cloroplasti. L’ esperienza permette di osservare la molecola del DNA (flocculo) ad occhio nudo e successivamente al microscopio ottico, dopo averla separata dall’involucro nucleare e cellulare in cui è contenuta all’interno della cellula. La procedura impiegata si basa sul fatto che le membrane cellulari e nucleari sono composte da sostanze grasse e, pertanto, possono essere disgregate utilizzando un semplice detersivo per piatti. Il campione biologico di partenza da cui si estrae il DNA può essere di vario tipo, preferibilmente frutta a polpa molle tipo il kiwi, ma possono essere utilizzati altri tipi di frutta. 

Questo esperimento è presente anche nella versione per le scuole secondarie di II grado: Estrazione di DNA da cellule vegetali

Scheda sintetica delle attività

• Allestire le postazioni con tutti i materiali necessari
• Suddividere la classe in gruppi di lavoro da quattro alunni per gruppo
• Fornire ad ogni gruppo il protocollo con il procedimento da effettuare per la realizzazione dell’esperimento
• Sbucciare un kiwi, schiacciarlo con la forchetta in un piatto fino a formare una poltiglia e versare la poltiglia in un becker
• Preparare la soluzione di lisi contenente cloruro di sodio e detersivo liquido per i piatti
• Mescolare la poltiglia di kiwi e la soluzione di lisi
• Filtrare il lisato
• Far precipitare il DNA rilasciato dalle cellule lisate mediante aggiunta di etanolo
• Recuperare il DNA precipitato e colorarlo per osservarlo al microscopio

Risorse

• 100 cl di acqua distillata o di rubinetto 
• 3 g di sale 
• Bacchetta 
• Bilancia 
• Piattino o ciotolina 
• Pipetta 
• Cilindro graduato 
• Colino a maglie strette 
• Carta assorbente 
• 2 provette da 15 ml
• Siringa da 10 ml
• Becher da 250 ml
• Etanolo (o alcol denaturato) freddo 
• 10 ml di detersivo per piatti 
• Kiwi 
• Forchetta o pestello 
• Coltello 
• Ansa (o file metallico o stuzzicadenti) 
• Vetrino portaoggetti e coprioggetti 
• Microscopio ottico 
• Blu di metilene (o altro colorante basico) 

Prerequisiti

• Conoscere la struttura della cellula
• Conoscere le funzioni degli organelli cellulari
• Conoscere la struttura e le caratteristiche della molecola del DNA 

Obiettivi di apprendimento

• Seguire le istruzioni e le procedure per eseguire correttamente l’estrazione del DNA 
• Riflettere sulla relazione tra l’attività sperimentale e il concetto teorico di DNA
• Comprendere il motivo per cui certi materiali (come il detergente o il sale) sono necessari per rompere le membrane cellulari
• Riconoscere che per comprendere fenomeni troppo piccoli è necessario riprodurre la realtà mediante costruzioni di modelli o mediante simulazioni
• Utilizzare le conoscenze di base e il metodo scientifico per giungere a conclusioni coerenti 

Dotazioni di sicurezza

Nessuna in particolare, ma se come colorante è disponibile il blu di metilene è necessario l’utilizzo di guanti.

Svolgimento

Premessa 

Esistono numerosi protocolli per estrarre semplicemente il DNA da diversi organismi viventi. Quello che vi viene presentato non ha bisogno di nessun apparecchio particolare e può essere eseguito grazie a prodotti di facile reperibilità. Da notare che il DNA che si ottiene non è puro, ma è contaminato da altre molecole (come le proteine) e da residui della lisi cellulare, ed è probabilmente parzialmente degradato. Tuttavia, possiamo visualizzare facilmente l’ammasso di DNA e apprezzarne l’aspetto filamentoso. 

Realizzazione 

• Sbucciare un kiwi e schiacciarlo con la forchetta in un piatto fino a formare una poltiglia (figura 1A)
• Versare la poltiglia in un becker da 250 ml (figura 1B)

Figura 1: Il kiwi sbucciato viene schiacciato con una forchetta (A) e la poltiglia versata in un becker da 250 ml (B)

• Versare 90 ml di acqua distillata in un cilindro graduato da 100 ml
• Trasferire l’acqua distillata dal cilindro graduato ad un becker da 100 ml
• Pesare 3 g di cloruro di sodio (NaCl; sale da cucina), aggiungerli nel becker da 100 ml 
• Contenente i 90 ml di acqua distillata e mescolare fino alla completa dissoluzione del sale
• Prelevare 10 ml di detersivo liquido per i piatti con una siringa senza ago ed aggiungerli alla soluzione di sale (figura 2)

• Mescolare gentilmente la soluzione di sale e detersivo evitando di produrre bolle
• Per lisare le cellule del kiwi, versare la soluzione di sale e detersivo nel becker da 250 ml contenente la poltiglia di kiwi (figura 3A)
• Incubare la sospensione per 15 minuti a temperatura ambiente agitandola di tanto in tanto
• Posizionare un colino sopra un becker pulito e adagiare sul colino un foglio di carta assorbente da cucina
• Versare la poltiglia di kiwi lisato sulla carta che avete posizionato sul colino (figura 3B) ed attendere circa 5 minuti
• Versate 5 ml del filtrato ottenuto in una provetta da 15 ml (figura 3C)

Figura 3: La soluzione di lisi viene versata nel becker contenente la poltiglia di kiwi (A),
la poltiglia di kiwi lisato viene filtrata (B), una aliquota della soluzione filtrata viene trasferita in una provetta pulita (C). 

• Prelevare con una siringa senza ago 5 ml di etanolo freddo e versarli lentamente lungo il bordo della provetta contenente il filtrato evitando che i due liquidi si mescolino (figura 4A)
• Lasciar riposare la provetta per 5 minuti per consentire al DNA di precipitare e di raccogliersi all’interfaccia tra il filtrato e l’etanolo (figura 4B)

Figura 4: l’etanolo freddo viene versato lentamente sulla soluzione filtrata (A);
il DNA precipitato è visibile all’interfaccia tra etanolo e soluzione filtrata (B). 

• Prelevare con un’ansa un po’ della sostanza gelatinosa presente all’interfaccia tra il filtrato e l’etanolo e depositarla su un vetrino portaoggetto
• Aggiungere sul vetrino una goccia di acqua distillata e mescolare delicatamente con l’ansa
• Colorare il preparato con una piccola goccia di blu di metilene e mescolare delicatamente con l’ansa
• Coprire il preparato con un vetrino coprioggetto e osservarlo al microscopio fino ad un ingrandimento 40X (se disponibile anche 100X). Non si riconoscerà la struttura a doppia elica del DNA, ma si vedranno flocculi colorati di blu che sono aggregati di filamenti di DNA (figura 5). 

Note e storia

Nell’esperimento presentato è necessario un approfondimento sulla funzione delle sostanze utilizzate.

• Il cloruro di sodio dissociato negli ioni sodio e cloro agisce su proteine legate al DNA, soprattutto gli istoni. La presenza di ioni in soluzione fa si che tali proteine si dissocino più facilmente dal DNA. Inoltre, gli ioni sodio che si liberano in soluzione neutralizzano le cariche negative della molecola del DNA facilitando la successiva precipitazione. 
• Il detersivo permette la lisi delle cellule dissolvendo le membrane cellulari. Il DNA è così liberato. 
• L’etanolo viene aggiunto lentamente e fatto scivolare lungo la parete della provetta in modo che, essendo più leggero dell’acqua, vi galleggi sopra. Il DNA, che prima si trovava in soluzione nell’acqua, ora si trova a contatto con l’etanolo; in quest’ambiente il DNA non è solubile; quindi, precipita (ovvero le singole molecole di DNA si associano tra loro) diventando ben visibile. 
• Il blu di metilene (o altri coloranti basici) è una sostanza basica che presenta affinità per tutte le molecole acide come il DNA. 

Precisazione 1: osservando il preparato al microscopio non vi aspettate di vedere la famosa struttura a doppia elica del DNA. Quando il DNA precipita, vedrete dei fiocchetti alquanto confusi (flocculi o effetto medusa) che appaiono bianchi e dalla consistenza gelatinosa ad occhio nudo, mentre appaiono come aggregati filamentosi blu quando osservati al microscopio. 

Precisazione 2: oltre che con il kiwi, questo esperimento può essere effettuato con altri tipi di frutta a polpa morbida (es. banane o fragole mature). 

Bibliografia

• Estrazione di DNA da cellule vegetali – Esperimento LS-OSA per la scuola secondaria di II grado
• Alla scoperta del DNA – Istituto Agrario di Cesena

Autori

Angela Emilia De Stefano, Scuola Secondaria di I grado “Cavour” – Modena